七類(lèi)消毒劑對(duì)非洲豬瘟病毒熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果的影響

南文龍1，鞏明霞1，陸游1，2，李林1，王清華1，吳曉東1，陳義平1

摘要：為評(píng)價(jià)戊二醛、酚、含碘類(lèi)等常用消毒劑消毒后對(duì)非洲豬瘟病毒熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果的影響，基于畜禽欄舍、運(yùn)載工具、器具消毒及皮膚黏膜消毒目的，按消毒劑說(shuō)明書(shū)推薦選擇不同工作濃度，分別與不同滴度的非洲豬瘟病毒培養(yǎng)物于20℃條件下作用30min后，采用熒光定量PCR方法檢測(cè)作用后產(chǎn)物。結(jié)果顯示，與對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照組相比，含氯類(lèi)（二氯異氰尿酸鈉）、過(guò)硫酸氫鉀類(lèi)、二氧化氯類(lèi)消毒劑，消毒后對(duì)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果影響最顯著，檢測(cè)Ct值顯著上升或檢測(cè)不到；戊二醛類(lèi)、含碘類(lèi)（主要成分聚維酮碘）消毒劑，核酸降解能力相對(duì)較弱，檢測(cè)Ct值稍有上升；酚類(lèi)、季銨鹽類(lèi)、含碘類(lèi)（主要成分碘、磷酸、硫酸）類(lèi)消毒劑，檢測(cè)Ct值基本無(wú)變化。本研究評(píng)價(jià)了7類(lèi)常用消毒劑消毒對(duì)非洲豬瘟病毒熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果的影響，可為防控實(shí)踐中科學(xué)、客觀評(píng)價(jià)分析消毒效果提供技術(shù)參考。

關(guān)鍵詞：非洲豬瘟；消毒劑；熒光定量PCR；消毒效果

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.61文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1005-944X（2021）03-0087-06DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2021.03.018

由于消毒劑滅活病毒機(jī)制不同，本研究擬采用熒光定量 PCR 方法檢測(cè)戊二醛、酚、含氯等 7 類(lèi) 9 種常用消毒劑與 ASFV 培養(yǎng)物作用后的產(chǎn)物，評(píng)估對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，以期為 ASF 防控實(shí)踐中科學(xué)、客觀評(píng)價(jià)分析消毒效果提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 消毒劑

收集市面常見(jiàn)的戊二醛、酚、含碘、季銨鹽、含氯、過(guò)硫酸氫鉀、二氧化氯等 7 類(lèi)消毒劑，包括戊二醛類(lèi)2 種、酚類(lèi)1 種，含碘類(lèi)2 種、季銨鹽1 種、含氯類(lèi) 1 種、過(guò)硫酸氫鉀類(lèi) 1 種、二氧化氯類(lèi) 1 種。消毒劑產(chǎn)品詳細(xì)信息見(jiàn)表 1，所有產(chǎn)品均注冊(cè)有獸藥產(chǎn)品批準(zhǔn)文號(hào)，試驗(yàn)時(shí)均在有效期內(nèi)。

1.2 病毒

ASFV 中國(guó)分離株：CN2018/1，由國(guó)家非洲豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存。

1.3試劑與耗材

DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清，購(gòu)自 GIBCO 公司；細(xì)胞瓶及 96 孔細(xì)胞板，購(gòu)自 Corning 公司；病毒RNA/DNA 提取試劑盒，購(gòu)自天根公司；熒光定量PCR 擴(kuò)增試劑 Luna 通用探針?lè)?qPCR 預(yù)混液，購(gòu)自 NEB 公司。

1.4 豬肺泡巨噬細(xì)胞、紅細(xì)胞和血清制備

無(wú)菌采集健康豬肺臟，向肺臟注入滅菌 PBS 灌洗數(shù)次，收集灌洗液；離心收集豬肺泡巨噬細(xì)胞， 按 5×106 個(gè) /mL、100 μL/ 孔接種 96 孔板；鋪板次日進(jìn)行測(cè)試。

同步無(wú)菌采集抗凝血，離心收集血清；之后將細(xì)胞沉淀洗滌 3~5 次，棄去白細(xì)胞和血小板，用PBS 配成 10% 豬紅細(xì)胞懸液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?

1.5 病毒滴度測(cè)定

采用含 1% 豬血清的 PBS 10 倍連續(xù)稀釋ASFV 培養(yǎng)物至 10-8，以每孔 100 μL 接種 96 孔板上的豬肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物，同時(shí)加入 1% 豬紅細(xì)胞 10 μL，每個(gè)稀釋度做 4 個(gè)重復(fù)孔。將 96 孔板置于 37 ℃ 5% CO2 條件下培養(yǎng) 6 d，每天觀察，記錄并統(tǒng)計(jì)各稀釋度培養(yǎng)孔中紅細(xì)胞吸附（HAD） 反應(yīng)結(jié)果，采用 Reed-Muench 法計(jì)算半數(shù)紅細(xì)胞吸附量（HAD50）。

1.6 消毒劑與 ASFV 作用

采用 PBS 10 倍連續(xù)稀釋經(jīng)病毒滴度測(cè)定后的ASFV 培養(yǎng)物，取 101~104 倍稀釋液備用。參考農(nóng)業(yè)農(nóng)村部文件《關(guān)于在非洲豬瘟防控中做好消毒劑選擇工作的通知》， 以有效滅活 ASFV 為目的，基于畜禽欄舍、運(yùn)載工具、器具消毒及皮膚黏膜（部分含碘類(lèi)消毒劑適用） 等不同消毒場(chǎng)景，按消毒劑說(shuō)明書(shū)標(biāo)明濃度范圍合理選擇工作濃度，并將消毒劑原液制成 10 倍工作濃度備用。將 0.1 mL 消毒劑 10 倍工作濃度液和0.1 mL 不同稀釋度病毒液分別加入到 0.8 mL PBS 中充分混合，20 ℃條件下作用 30 min，作用后產(chǎn)物直接用于后續(xù)測(cè)試。無(wú)法制成 10 倍工作濃度液的含碘類(lèi)消毒劑 C1，按照 1:2 工作濃度，將 0.5 mL 消毒劑原液和 0.1 mL 不同稀釋度病毒液，分別加入到 0.4 mL PBS 中充分混合，按相同條件作用處理，作用后產(chǎn)物直接用于后續(xù)測(cè)試。陽(yáng)性對(duì)照組， 直接將 0.1 mL 不同稀釋度病毒液加入 0.9 mL PBS 中充分混合；陰性對(duì)照組，直接取 1 mL PBS。陰、陽(yáng)性對(duì)照均按相同條件作用處理，作用后產(chǎn)物直接用于后續(xù)測(cè)試。

1..7 病毒 DNA 提取

取 200 μL 上述作用后產(chǎn)物，按病毒 RNA/ DNA 提取試劑盒說(shuō)明，于 Thermo 自動(dòng)核酸提取儀上提取病毒核酸，將提取的核酸保存于 -80 ℃冰箱備用。

1..8 熒光定量 PCR 擴(kuò)增

采用 OIE《陸生動(dòng)物診斷實(shí)驗(yàn)和疫苗手冊(cè)》（2012 版）第 2.8.2 章節(jié)中，King 等 [1] 基于 VP72蛋白建立的 ASFV 熒光定量 PCR 方法檢測(cè)。上、下游引物和探針由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系為：2×qPCR 預(yù)混液 10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各 0.8 μL，探針（10 μmol/L）0.4 μL，模板 DNA 2 μL，最后用滅菌水補(bǔ)齊至20 μL。反應(yīng)條件為：50 ℃孵育 2 min；95 ℃預(yù)變性 3 min；95 ℃預(yù)變性 15 s，58 ℃退火延伸 1 min（采集 FAM 熒光信號(hào)），共 40 個(gè)循環(huán)。

1.9 檢測(cè)結(jié)果分析

按 1.6—1.8 步驟，重復(fù)處理各組樣品 3 次并檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)平均 Ct 值，計(jì)算批間變異系數(shù)；取同一批次提取核酸重復(fù)檢測(cè) 3 次，統(tǒng)計(jì)平均 Ct 值， 計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)。統(tǒng)計(jì)各組檢測(cè)平均 Ct 值，將各組檢測(cè)結(jié)果分別與對(duì)應(yīng)陽(yáng)性對(duì)照組比較，采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，以 P ＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病毒滴度測(cè)定

經(jīng) 測(cè) 定，ASFV 培 養(yǎng) 物 病 毒 滴 度 為 107.2 HAD50/mL。采用 PBS 10 倍連續(xù)稀釋后，本試驗(yàn)中與消毒劑作用的 ASFV 滴度為 102.2~105.2 HAD50/mL。

2.2 各消毒劑檢測(cè)結(jié)果

消毒劑在選定稀釋度下與不同滴度 ASFV 作用后，采用熒光定量 PCR 檢測(cè)，結(jié)果詳見(jiàn)表 2。重復(fù)處理樣品檢測(cè) 3 次，各組平均 Ct 值批間變異系數(shù)為 0.3%~6.7%；取同一批次樣品提取病毒核酸重復(fù)檢測(cè) 3 次，各組平均 Ct 值批內(nèi)變異系數(shù)為0.1%~2.3%。

結(jié)果（表 2）顯示，本研究中不同滴度 ASFV 與戊二醛類(lèi)消毒劑作用后，熒光定量 PCR 檢測(cè) Ct 值均顯著上升。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，戊二醛類(lèi) A1 產(chǎn)品 1:80~1:200 稀釋下，當(dāng)病毒滴度為 105.2~103.2 HAD50/mL 時(shí)，檢測(cè) Ct 值上升約 3.19~4.15；當(dāng)病毒滴度為 102.2 HAD /mL 時(shí)，未檢測(cè)到 Ct 值。A2 產(chǎn)品在 1:80~1:200 稀釋滅活不同滴度病毒后，檢測(cè) Ct 值上升 1.21~4.33。

酚類(lèi)B 產(chǎn)品與不同滴度病毒作用后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)， 與對(duì)應(yīng)陽(yáng)性對(duì)照組測(cè)定 Ct 值基本相當(dāng)，僅個(gè)別檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn) Ct 值波動(dòng)（如 1:200 工作濃度下滅活102.2 HAD /mL 病毒時(shí)），總體看酚類(lèi) B 產(chǎn)品滅活病毒后對(duì)熒光定量 PCR 檢測(cè)結(jié)果影響不大。

含碘類(lèi)C1 產(chǎn)品，當(dāng)滅活病毒滴度為 105.2~104.2 HAD50/mL 時(shí)，檢測(cè) Ct 值變化不顯著；當(dāng)滅活病毒滴度為 103.2~102.2 HAD /mL 時(shí)，檢測(cè) Ct 值顯著上升 3.45~5.76。C2 產(chǎn)品與不同滴度病毒作用后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)滅活病毒滴度為103.2~105.2 HAD /mL 時(shí)， 比對(duì)應(yīng)陽(yáng)性對(duì)照組測(cè)定Ct 值稍有上升（0.46~1.06）；僅滅活病毒滴度為 102.2 HAD /mL 時(shí)，2.00% 稀釋度下檢測(cè)結(jié)果 Ct 值明顯上升（約 2.46）。

季銨鹽類(lèi) D 產(chǎn)品與不同滴度病毒作用后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)應(yīng)陽(yáng)性對(duì)照組測(cè)定 Ct 值基本相當(dāng)，基本無(wú)顯著差異。

含氯類(lèi) E 產(chǎn)品與不同滴度病毒作用后檢測(cè)， 均未檢測(cè)到 Ct 值。

過(guò)硫酸氫鉀類(lèi) F 產(chǎn)品，當(dāng)滅活病毒滴度為105.2 HAD /mL 時(shí)，檢測(cè) Ct 值上升約 1.68；當(dāng)滅活病毒濃度為 104.2~102.2 HAD /mL 時(shí)，均未檢測(cè)到 Ct 值。

二氧化氯類(lèi) G 產(chǎn) 品，當(dāng)滅活病毒滴度為 105.2~104.2 HAD /mL 時(shí) ， 檢 測(cè) Ct 值 上 升5.17~7.52；當(dāng)滅活病毒滴度為 103.2~102.2 HAD /mL時(shí)，均未檢測(cè)到 Ct 值。

3 討論

ASFV 屬于囊膜 DNA 病毒，對(duì)環(huán)境抵抗力強(qiáng)， 但對(duì)戊二醛、含氯、含碘類(lèi)等多數(shù)常用種類(lèi)消毒劑敏感 [2]?，F(xiàn)場(chǎng)消毒后，常需對(duì)消毒效果進(jìn)行監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)，以防止由于消毒不徹底造成 ASFV 傳播擴(kuò)散。目前，采用病毒分離方法只能在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部指定實(shí)驗(yàn)室中開(kāi)展，且技術(shù)難度大、檢測(cè)周期長(zhǎng)，而檢測(cè)抗原的 ELISA 或膠體金等免疫學(xué)檢測(cè)方法敏感性達(dá)不到消毒效果評(píng)價(jià)要求。分子生物學(xué)方法特別是熒光定量 PCR 方法，具有簡(jiǎn)便、快速、高通量等優(yōu)勢(shì)，是實(shí)踐中 ASFV 病原檢測(cè)最主要手段，且適用于唾液、血液、組織、環(huán)境拭子等多種樣品類(lèi)型，可廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖場(chǎng)、屠宰場(chǎng)、無(wú)害化處理廠、運(yùn)輸車(chē)輛等多種場(chǎng)景消毒效果評(píng)估。

結(jié)果顯示，與其他幾種消毒劑相比，含氯類(lèi)（二氯異氰尿酸鈉）、過(guò)硫酸氫鉀類(lèi)、二氧化氯類(lèi) 3 類(lèi)消毒劑，消毒后對(duì)熒光定量 PCR 檢測(cè)結(jié)果影響最顯著，檢測(cè) Ct 值明顯上升或未檢測(cè)到，且其影響能力排序?yàn)椋汉阮?lèi)（二氯異氰尿酸鈉）＞ 過(guò)硫酸氫鉀類(lèi)＞二氧化氯類(lèi)。含氯類(lèi)消毒劑（二氯異氰脲酸鈉）遇水后可釋放出次氯酸，可導(dǎo)致病原蛋白質(zhì)變性、改變膜通透性并可直接影響 DNA 合成等來(lái)殺滅病原 [3]。本研究中含氧類(lèi)消毒劑與滴度≤ 105.2 HAD /mL 病毒作用后檢測(cè)，均未見(jiàn) Ct 值。當(dāng)前市售過(guò)硫酸氫鉀類(lèi)消毒劑，多由過(guò)硫酸氫鉀、表面活性劑、無(wú)機(jī)鹽與有機(jī)酸等組成，其消毒原理：一是利用過(guò)硫酸氫根的強(qiáng)氧化能力，在水溶液中產(chǎn)生羥基自由基等改變微生物細(xì)胞膜的通透性使之破裂；二是使用時(shí)過(guò)氧離子能將氯離子氧化為次氯酸，達(dá)到殺滅病原目的 [4]。本研究中過(guò)硫酸氫鉀類(lèi)消毒劑與滴度為 105.2 HAD /mL 病毒作用后檢測(cè)時(shí) Ct 值上升，與≤ 104.2 HAD /mL 病毒作用后檢測(cè)未見(jiàn) Ct 值。二氧化氯類(lèi)消毒劑是一類(lèi)強(qiáng)氧化劑，并兼具含氯類(lèi)消毒劑作用機(jī)制，可與細(xì)胞內(nèi)部酶發(fā)生氧化反應(yīng)，還可氧化分解氨基酸、核酸等，使微生物蛋白質(zhì)的合成被抑制并導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能喪失 [5]。本研究中當(dāng)二氧化氯類(lèi)消毒劑與滴度104.2~105.2 HAD /mL 病毒作用后檢測(cè) Ct 值上升， 與≤ 103.2 HAD /mL 病毒作用后檢測(cè)均未見(jiàn)Ct 值， 可推斷其核酸降解能力弱于前兩者。

戊二醛類(lèi)消毒劑，主要通過(guò)凝固病原微生物蛋白質(zhì)中的氨基、羧基，破壞病原微生物蛋白分子使其死亡 [6]，在本研究中戊二醛類(lèi)消毒劑顯示較弱的核酸降解能力。A1 產(chǎn)品僅當(dāng)與滴度≤ 102.2 HAD50/mL 病毒作用后檢測(cè)未見(jiàn)Ct 值。A1、A2 相比， 當(dāng)滅活病毒滴度為 102.2 HAD /mL 時(shí)，A2 仍可檢測(cè)到 Ct 值而 A1 未檢測(cè)到，表明 A1 對(duì)檢測(cè) Ct 值影響大于 A2，推測(cè)可能與 A1 具有更高戊二醛工作濃度有關(guān)。

含碘類(lèi)消毒劑消毒時(shí)，游離狀態(tài)的碘原子產(chǎn)生強(qiáng)氧化作用，主要破壞病原體的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)分子，并可部分作用于核酸 。本研究中顯示含碘類(lèi)消毒劑具有較弱的核酸降解能力，C1 僅當(dāng)與滴度為 103.2~102.2 HAD /mL 病毒作用后，檢測(cè)Ct 值出現(xiàn)上升。

本研究中的酚類(lèi)和季銨鹽類(lèi)消毒劑，消毒后與對(duì)應(yīng)陽(yáng)性對(duì)照組測(cè)定 Ct 值基本相當(dāng)。酚類(lèi)屬于原生質(zhì)毒物，可穿透破壞細(xì)胞膜、沉淀蛋白質(zhì) [2]；季銨化合物是一種膜活性劑，可損傷、破壞細(xì)胞膜， 導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)電位和 pH 梯度變化 [2]，兩者在消毒原理上對(duì)核酸作用小。

采用熒光定量 PCR 檢測(cè)評(píng)估對(duì) ASFV 的消毒效果時(shí)，未檢測(cè)到 Ct 值的原因：一方面是消毒劑本身即具有核酸降解能力，另一方面是消毒前后進(jìn)行的清潔、清洗也會(huì)清除 ASFV 核酸。由于熒光PCR 方法原理是對(duì)病毒核酸檢測(cè)，現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)時(shí)若結(jié)果陽(yáng)性，僅表示存在 ASFV 核酸，并不能說(shuō)明病毒本身是否存活，是否達(dá)到有效滅活效果還應(yīng)根據(jù)現(xiàn)場(chǎng)條件以及使用消毒劑種類(lèi)、使用濃度、作用時(shí)間等因素綜合分析。此外，也可考慮采用指示微生物方式進(jìn)行輔助的消毒效果驗(yàn)證。綜上所述，本研究評(píng)估了 7 類(lèi) 常用消毒劑滅活 ASFV 后，對(duì)熒光定量 PCR 檢測(cè)結(jié)果的影響，可為 ASFV 消毒效果評(píng)價(jià)提供技術(shù)參考。

參考文獻(xiàn)（略）